سپاسگزاري:

از تمام کساني که در اين پروژه مرا ياري دادند به ويژه استاد راهنماي گرانقدرم سرکارخانم دکتر هاله سلطان قرايي و استاد محترم جناب آقاي دکتر عبدالحسين شيروي که با پذيرفتن مشاورت اين پژوهش مساعدت خود را مبذول داشتند و مشاورآماري گرامي ،استاد ارجمند آقاي دکتر سعيد زارعي که همواره از پشتيباني ايشان در اين پايان نامه بهره مند شدم و همچنين از جناب آقاي دکتر علي آهني قدرداني مي نمايم. در نهايت از تمام همکاران محترم پژوهشگاه فناوري هاي نوين علوم پزشکي جهاد دانشگاهي و اعضاي محترم گروه ژنتيک سرکار خانم ها هاله عدالتخواه،ميترا ساکت ،ژامک پهلوان زاده مخصوصا جناب آقاي کيومرث سليمي نژاد که بدون مساعدت و همکاري آنان انجام اين پروژه امکان پذير نبود سپاس گزارم.

تقديم به:

پدر و مادر عزيزو مهربانم که هميشه در خلوت ميان خود و خدايشان پيروزي و موفقيتم را از کاشانهي خالق هستي خواستارند و نهال?سبز دعا رادر سرزمين ايمان ميکارند تا شاهد بالندگي من باشند.

?.همسرعزيزم که صبورانه کاستي هاي مرا در طول دوران تحصيل با آغوش باز پذيرفت وهمواره مرادر بهتر بودن و بهتر شدن ياري رساند.?

فهرست مطالب
عنوان صفحه
1- کليات 16
1-1- مقدمه 16
1-2- بيان مسئله 16
1-3- ضرورت پژوهش 17
1-4- اهداف پژوهش 17
1-5- چارچوب انجام پژوهش 17
1-5-1- سقط مکرر 17
1-5-2- علل سقط 18
1-5-3- ژنتيک 19
1-5-4- ترومبوفيليا 19
1-5-5- عوامل آناتوميک 20
1-5-6- اختلالات آندوکرين 20
1-5-7- علل عفوني 21
1-5-8- علل ايمني. 21
1-5-9- عوامل ديگر 22
1-6- سيستم ايمني 23
1-6-1- ايمني اکتسابي 24
1-6-2- ايمني ذاتي 26
1-6-3- سيستم ايمني و بارداري 28
1-7- ويتامين D3 29
1-7-1- سنتز ويتامين D3 30
1-7-2- کليات مکانيسم اثر ويتا مين D3 31
1-7-3- اثرات calcitriol بر سيستم ايمني 32
1-7-4- 1.25(OH)2D3 و سيستم ايمني 32
1-7-5- ويتامين D3 وبارداري 34
1-8- رگ زا?? 35
1-8-1- فاکتور رشد اندوتل?ال عروق? (VEGF) 36
1-8-2- گيرنده هاي ?VEGF 38
1-8-3- عملکرد ?VEGFو نقش آن در بارداري 38
2- مروري بر مطالعات گذشته 40
2-1- مقدمه 40
3- روش بررسي 47
3-1- جمعيت مورد مطالعه 47
3-2- استخراج DNA به روش( Salting out) 47
3-2-1- تهي? محلولهاي مورد نياز 48
3-3- بررسي کمي و کيفي استخراج DNA 49
3-3-1- بررسي کمي DNA استخراج شده با اسپکتروفوتومتر 49
3-3-2- مواد و وسايل لازم 50
3-3-3- مراحل انجام کار 50
3-3-4- محاسبه غلظت DNA 50
3-3-5- بررسي کيفيDNA. 51
3-4- ژنوتايپ کردن نمونهها (ژنوتايپينگ) 52
3-4-1- انتخاب پرايمرهاي مناسب براي هر موتاسيون 52
3-5- واکنش زنجيرهاي پلي مراز. 57
3-5-1- مواد و وسايل لازم 57
3-5-2- روش کار 57
3-5-3- الکتروفورز ژل آگارز 59
3-5-4- طرز تهيه بافر ?1 59
3-5-5- طرز تهيه ژل آگارز 60
3-5-6- روش کار جهت Run کردن نمونه ها روي ژل آگارز 60
3-6- چندشکلي در طول قطعات محدود 60
3-7- روش انجام RFLP بر روي محصولات PCR 61
3-8- روشهاي آماري مورد استفاده 62
4- نتايج و يافته ها 64
4-1- بررسي کيفيت DNA هاي استخراج شده 64
4-2- نتايج PCR 64
4-3- نتايج RFLP 67
4-3-1- پلي مورفيسم خانواده VEGF 67
4-3-2- پلي مورفيسم C/T 936: 67
4-3-3- پليمورفيسم FOKI 68
4-3-4- پلي مورفيسم 2578 در ژن VEGF 69
4-3-5- پلي مورفيسمC/T 936 در ژن VEGF: 69
4-3-6- پلي مورفيسم 27823 در ژنVDR: 70
4-3-7- بررسي سطح سرمي ويتامين D باپلي مورفيسم FOKIدر ژن رسپتور ويتامين D: 71
4-4- بررسي نتايج آماري: 72
5- بحث ونتيجه گيري 74
6- منابع 82

عنوان جدول صفحه
جدول 1-1 : فراواني عوامل سقط مکرر در 545 زن مبتلا به RSA 21
جدول 3-1 : مواد لازم براي استخراج DNA 47
جدول 3-2 : مشخصات پرايمر 56
جدول 3-3 :مواد لازم براي واکنش پلي مراز 57
جدول 3-4 : حجم و غلظت مواد بکار رفته در PCR 58
جدول 3-5 : برنامه زماني PCR مورد استفاده در دستگاه ترموسيکلر 58
جدول 3-6 : مواد لازم براي تهيه بافر 59
جدول 4-1 : پرايمرهاي استفاده شده و آنزيم محدودالاثر 64
جدول 4-2 : برنامه PCR بهينه شده براي هر جفت پرايمر 65
جدول 4-3 : مقايسه فرکانس اللي و ژنوتايپي پلي مورفيسم 2578 69
جدول 4-4 : جدول مقايسه اللي و ژنوتايپي کنترل و بيمار در پلي مورفيسم 936 70
جدول 4-5 : بررسي اللي و ژنوتايپي 27823 در گروه کنترل و بيمار 71
جدول 4-6 : سطح سرمي ويتامين D 71
جدول 4-7 : بررسي فراواني پلي مورفيسم هاي 2578و936.27823? 72

عنوان شکل صفحه
شکل 1-1 : سيستم ايمني 24
شکل 3-1 : محاسبه غلظت و ميزان جذب در نمونه ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر 51
شکل 3-2 :الکتروفورز براي تعيين آناليز کيفي 52
شکل3-3 : نرم افزار بلاست 55
شکل 3-4 : با نرمافزار GENE RUNNER 56
شکل 3-5 : نرم افزار 61
شکل 3-6 : مشاهده ژل آگاروز 62
شکل 4-1 : بررسي کيفيتDNA بر روي ژل اگاروز1% 64
شکل 4-2 : الکتروفورز محصول PCR براي موتاسيونA/C2578: َ1.2.3.4.: باند 476BP،.مارکر BP،100؛باندمنفي 65
شکل 4 -3 : الکتروفورز محصول PCR براي پلي مورفيسم T/C 27823::باندهاي 1.2.3.4محصول PCR باند273،کنترل منفي، مارکر100BP 66
شکل 4-4 : الکتروفورز محصول PCR براي موتاسيون936C/T باندهاي 1.2.3 محصول PCR باند 198BP و مارکر 100BP . و کنترل منفي 66
شکل 4-5 : الکتروفورز پس از ? RFLP?بر روي محصوالت PCR?پلي مورفيسم ? A/C 2578 ?با استفاده از??آنزيم محدوداالثر C :BGLII?قطعه تکثير شده 476 جفت باز بعنوان کنترل M- مارکر وزن مولکولي? 50 BP 4.5- هتروزيگوت?1- هموزيگوت بيمار 67
شکل 4-6 : الکتروفورز پس ا ? RFLP?بر روي محصولات ? PCR?پلي مورفيسم ? +936C/T?با استفاده از??آنزيم محدوداالثر NLAIII I?قطعه تکثير شده 198 جفت باز بعنوان کنترل M- مارکر وزن مولکولي? 50 BP ،3، 2 ?و 6 – هتروزيگوت?5- هموزيگوت بيمار 68
شکل 4-7 : الکتروفورز پس از ? RFLP?بر روي محصوالت ? PCR?پلي مورفيسم C/T?? FOKIاستفاده از??آنزيم محدوداالاثر- :ّFOKI?قطعه تکثير شده 273 جفت باز بعنوان کنترل M- مارکر وزن مولکولي? 50 BP ،3,4 – هتروزيگوت 68
شکل 4-8 : مقايسه بين فرکانس اللي و ژنوتايپي کنترل و بيمار 69
شکل 4-9 : بررسي اللي و ژنوتايپي گروه کنترل و بيمار در پلي مورفيسم 936 70
شکل4-10 : بررسي گروه اللي و ژنوتايپي پلي مورفيسم 27823 71

فهرست علامت هاي اختصاري
علامت
معادل انگليسي
معادل فارسي
OD
Optical Density
چگالي نوري
DDW
Division of Drinking Water
آب دو بار تقطير
R
Receptor
گيرنده
HLA
Human leukocyte antigen
آنتي ژن لکوسيت انساني
HCG
Human chorionic gonadoteropin
گنا دوتروپين جفتي انساني
PCR
Polymerase chain Reaction
واکنش زنجيره اي پلي مراز
SPSS
Statistical pakeage for social sciences
امار اجتماعي
Mg
Microgram
ميکرو گرم
µl
Micro litre
ميکرو ليتر
EDTA
Ethylen diamine tetra-acetic
اتيلن دي امين تترا استيک اسيد

1-

چکيده:
سقط مکرر شايع ترين رويداد پزشکي ، که در طول 3 ماهه اول در 20% از بارداري ها رخ مي‌دهد. سقط مکرر از بيماريهايي است که بسياري از زوجها از آن رنج مي برندعوامل متعددي براي اين سندرم ذکر شده است که يکي از علل مطرح آن موتاسيون در ژن هاي رسپتور ويتامين D وفاکتور رشد اندوتليال عروقي در مادران باردار و به دنبال آن سقط جنين است.نظر به اينکه جمعيت مردم ايران از نظر ژنتيکي با جمعيتهاي ديگر متفاوت است ، لذا موتاسيون ژنهاي فاکتور رشد اندوتليال عروقي در ايران ممکن است با ديگر جوامع متفاوت باشد لذا اين مطالعه ميتواند تصويري از ترکيب ژني مردم ايران در ارتباط با موتاسيون هاي مربوط به ژنهاي فاکتور رشد اندوتليال و احتمالا ارتباط آنها با سقط مکرر را مشخص کند. لذادر مورد ارتباط رسپتور ويتامين D و سندرم سقط مکرر گزارشي ديده نشده است
روش کار:
اين بررسي با ژنوتيپ کردن نمونه DNA گروه بيماران (Case) و گروه سالم (Control) و مقايسه فراواني اين موتاسيون ها در دو گروه به وسيله آزمون x 2 انجام ميگيرد آناليز نتايج حاصل از اين مرحله ، ژنوتيپهاي ايجادکننده ريسک براي موتاسيون هاي مذکور و همچنين ريسک نسبي ايجاد شده را با محاسبه ((Odd Ratio مشخص خواهد نمود در نهايت ميزان ارتباط هر يک از اين موتاسيون ها به صورت هموزيگوت و هتروزيگوت به طور جداگانه و نيز بصورت هتروزيگوت مرکب (دو يا چند موتاسيون هم زمان ) با شيوع سقط مکرر در زنان با تفسير نتايج و اطلاعات بدست آمده ، مورد بررسي قرار خواهدگرفت.
نتايج:
فراواني هاي ژنوتيپي و آللي دو پلي مورفيسمسم 936C/T،FOKIT/C از ژنVDR,VEGFهيچ تفاوت معني داري را بين گروه بيمار و کنترل نشان نداد. در مقابل فراواني ژنوتيپي در پلي مورفيسم 2578C/Aتفاوت معني داري را بين بيماران و کنترل نشان داد.با توجه به تاثير و اهميت تروفوبلاست ، رگهاي جنيني و رشد سلول هاي خوني جنيني و مادري در سندرم سقط مکرر توجه به VEGF و بررسي تاثير پليمورفيسم هاي اين ژن در سقط مکرر ضروري مي باشد.از آنجاييکه مشاهداتي مبني بر ارتباط معني دار ژن VDR با سرطان وپارگي زودرس غشا ملاحظه کرديم .لازم دانستيم ارتباط اين ژن را با سندرم سقط مکررکه گزارشي از آن منتشر نشده مورد بررسي قرار دهيم.
بحث: يافته هاي ما پيشنهاد مي کند که پلي مورفيسم2578C/Aممکن است با استعداد ابتلا به سقط مکرر در جمعيت ايراني مرتبط باشد .
کليد واژه:
سقط مکرر، رسپتور ويتامين د، وزيکول اندوتليال عروقي،

فصل اول

کليات

1-
کليات
1-1- مقدمه
توليد مثل تنها راه بقا نسل بشر و تداوم وجود او بر روي کره ي خاکي است. ميل به داشتن فرزند و تداوم نسل، از انگيزهها و اهداف مهمي است که همواره در دورههاي مختلف تاريخي موجب ازدواج و تشکيل خانواده شده است و چنانچه در اين راستا خللي وارد شود، غم و اندوه بزرگي بر زندگي افراد سايه ميافکند. نقش مادر در اين ميان بسيار مهم است.

1-2- بيان مسئله
در حدود 20 – 15% از حاملگي ها باليني به طور خود به خود سقط مي شوند بنابراين سقط جنين شايعترين عارضه در دوران حاملگي انسان است . که 1% از اين سقطها به صورت مکرر مي باشد. طبق تعريف، سقط مکرر خود به خودي به وقوع سه يا بيش از سه سقط جنين قبل از هفته بيستم حاملگي اطلاق مي شود.اساس ژنتيكي سقط مكرر به طور کامل شناخته نشده است، ولي بررسي هاي انجام شده نقش تعدادي از موتاسيونها در ژنهاي مختلف، چندشکليهاي اين ژنها و اختلالات سيتوژنتيک را در ايجاد اين سندرم نشان دادهاند.مکانيزم هاي ايمونولوژيک تحمل مادر نسبت به جنين بسيار متنوع بوده و دراين تنظيم ايمني عوامل مختلف و متعددي نظير سيتوکين ها ، هورمون ها ، واسطه هاي التهابي ،سلولهاي سيستم ايمني نظير لنفوسيتT لنفوسيتB نقش دارند. سايتوکاينها، پروتئينها يا گليکوپروتئينهاي تعديل کننده سيستم ايمني هستند که فعاليتهاي اين سيستم را کنترل و تنظيم ميکنند. آنها از طريق اتصال به گيرندههاي سايتوکايني اختصاصي و سپس به راه اندازي مسيرهاي انتقال پيام و پيامبرهاي ثانويه، بر سلولهاي هدف اثر مي گذارند. سطح توليد سايتوکاين ها تحت کنترل ژنتيک است. تعداد بسياري از پلي مورفيسمهاي موجود در ژنهاي سايتوکايني و پذيرنده هاي آنها در مناطق پروموتور، مناطق اينتروني و مناطق غير قابل ترجمه واقع هستند. انواع سلول هايT کمکي که شامل Th1وTh2 مي باشد و هر کدام از آنها سايتوکاينهاي ويژهاي را ترشح ميکنند.
سايتوکاينهاي تيپ

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید