حجم گاز، دقت پيش‌گويي ماده آلي قابل هضم در حيوان زنده را بهبود مي‌بخشد و از سوي ديگر در اين روش تعداد زيادي از نمونه‌ها را مي‌توان آناليز کرد (ماکار، 2005). از آنجايي که گاز توليدي حاصل از تخمير در زمان‌هاي متفاوتي ثبت مي‌شود، امکان تعيين ميزان و سرعت مواد خوراکي هم وجود دارد (منصوري و همکاران، 1381).
معايب آزمون گاز اين است که تخمير خوراک به صورت خطي با توليد گاز مرتبط نمي‌باشد و از اين رو تفسير آن مشکل است (گروت و همکاران، 1998). خوراک‌هايي که پروپيونات بيشتري توليد مي‌کنند در مقايسه با خوراک‌هايي که استات و پروپيونات بيشتري توليد مي‌کنند، گاز کمتري توليد مي‌نمايند که اين کار باعث پيچيده‌تر شدن تفسير نتايج آزمون گاز مي‌شود (جانگ و همکاران، 1995).

2-2-5- آماده‌سازي عصاره‌ها براي آزمون گاز
براي تهيه سطوح 100، 200 و 300 ميلي‌ گرم بر ليتر از عصاره‌ها مقدار 01/0، 02/0 و 03/0 ميلي گرم از هر عصاره به وسيله‌ي ترازوي ديجيتال توزين شده و به طور جداگانه در نيم ميلي ليتر حلال متانول حل گرديد سپس حجم هر يک از محلول‌هاي حاصل با آب مقطر به 2 ميلي ليتر رسانده شد.

2-2-6- آماده‌سازي نمونه خوراک و سرنگ‌ها
در اين روش، براي اندازه‌گيري تخمير از سرنگ‌هاي شيشه‌اي مدرج مخصوص، با قطر داخلي 32 ميلي متر و طول 200 ميلي متر و با حجم 100 ميلي ليتر، استفاده گرديد. روز قبل از آزمايش حدود 200 ميلي گرم از ماده خشک نمونه خوراک مورد آزمايش شامل علوفه يونجه و کاه (به نسبت 3 به ا) و کنسانتره (جو 08/15، ذرت 08/15، سويا 03/6، سبوس گندم 02/3، کربنات کلسيم 45/0 و مکمل ويتامين45/0بر حسب درصد) به نسبت 60 (علوفه) به 40 (کنسانتره) که قبلا آسياب و با توري يک ميلي متري الک گرديده بود، به داخل هر سرنگ ريخته شد. به منظور حرکت آسان‌تر پيستون و همچنين جلوگيري از خروج گاز در حين تخمير، اطراف پيستون با وازلين آغشته گرديد. پس از قرار دادن پيستون در داخل سرنگ، سرنگ‌ها در داخل انکوباتور 39 درجه سانتيگراد گرم شدند. براي هر نمونه 3 تکرار استفاده شد.

2-2-7- تهيه مايع شکمبه
مايع شکمبه از سه گاو نر تالشي فيستولادار استفاده شد. اين گاوها از نژاد تالشي با وزن متوسط 400 تا 450 کيلوگرم بودند که در سطح نگهداري با جيره مورد نظر تغذيه شده بودند. شيرابه حدود نيم ساعت قبل از وعده خوراک صبح از طريق فيستول جمع‌آوري و با استفاده از دو لايه پارچه مخصوص صاف گرديده و در فلاسک محتوي گاز کربنيک ريخته شد و با قرار دادن ظرف محتوي مايع شکمبه در آب گرم 39 درجه سانتيگراد، سريعا به آزمايشگاه منتقل گرديد.

2-2-8- تهيه بزاق مصنوعي
براي تهيه مخلوط بزاق مصنوعي مطابق روش منک و همکاران (1979) و روش تصحيح شده منک و استينگس (1978)، روز قبل از آزمايش مقدار کافي از محلول مواد معدني کم نياز (محلولA) محلول مواد معدني اصلي (محلول C)، محلول بافر مواد معدني (محلول B) و محلول ريزازورين 1/0% و محلول احياکننده به طور جداگانه تهيه گرديد و براي مصارف بعدي در يخچال و در دماي 4 درجه سانتيگراد نگهداري شد (جداول 2-1 الي 2-6).
جدول 2-1- محلول مواد معدني کم نياز (A)
ترکيب شيميايي مقدار (گرم)
کلريد کلسيم (O2H2 .2CaCl) 13/2
کلريد منگنز (O2H4 .2MnCl) 10/0
کلريد کبالت (O2H6 .2CoCl) 1/0
کلريد آهن (O2H6 .3FeCl) 0/8
حجم محلول با آب مقطر به 100 ميلي ليتر رسانده شد.
جدول 2-2- محلول مواد معدني اصلي (C)
نوع مواد مقدار (گرم)
فسفات هيذروژن سديم (4HPO2Na) 5/7
فسفات هيدروژن پتاسيم (4PO2KH) 6/2
سولفات منيزيم (O2H7 .4MgSO) 0/6
حجم محلول با آب مقطر به 1000 ميلي ليتر رسانده شد.

جدول 2-3- محلول بافر مواد معدني (B)
نوع مواد مقدار(گرم)
بيکربنات سديم (3NaHCO) 35/0
بيکربنات آمونيوم (3HCO (4NH)) 4/0
حجم محلول با آب مقطر به 1000 ميلي ليتر رسانده شد.

جدول 2-4- محلول ريزازورين
100 ميلي گرم در 100 ميلي ليتر آب مقطر

جدول 2-5- محلول احياء کننده
نوع مواد مقدار مواد
آب مقطر 47/5 ميلي ليتر
سود يک نرمال (N 1 NaOH,) 2/0 ميلي ليتر
سولفيد سديم (O2H7 . S2Na) 285/0 ميلي گرم

جدول 2-6- نسبت محلول‌ها در ترکيب بزاق مصنوعي
نوع محلول مقدار(ميلي ليتر)
آب مقطر 474/0
محلول A 0/12
محلول B 237/0
محلول ريزازورين 1/22
محلول احياء کننده 49/50

2-2-9- تهيه نمونه شاهد
با توجه به اينکه مايع شکمبه گرفته شده حاوي مقداري مواد مغذي است که بدون قرار دادن نمونه خوراک در سرنگ‌ها هم مقداري گاز توليد مي‌کند، براي تصحيح گاز توليدي با منشا مايع شکمبه، در هر مرحله در سه عدد سرنگ بدون استفاده از نمونه خوراک فقط 30 ميلي ليتر از مخلوط مايع شکمبه و بزاق مصنوعي ريخته شد (نمونه شاهد) و در هر زمان اندازه‌گيري، ميانگين گاز توليدي در اين سرنگ‌ها، از حجم گاز توليدي در سرنگ‌هاي محتوي نمونه خوراک کسر شد تا مقدار گاز توليدي ناشي از تخمير خوراک مورد آزمايش به دست آيد.

2-2-10- تزريق مخلوط بزاق مصنوعي و مايع شکمبه در سرنگ‌ها
مقدار 474 ميلي ليتر آب مقطر، 12/0 ميلي ليتر محلول A، 237 ميلي ليتر محلول C و 237 ميلي ليتر محلول B در بالن دو ليتري ريخته شد و در حالي که جريان مستمر گاز کربنيک به داخل مخلوط برقرار بود و با همزن الکتريکي هم زده مي‌شد، آن را به آرامي حرارت داده تا به دماي 39 درجه سانتيگراد رسيد. در مرحله بعدي محلول احياء کننده شامل 5/47 ميلي ليتر آب مقطر، 2 ميلي ليتر سود يک نرمال و 285 ميلي گرم O2H7 . S2Na تهيه گرديد و به مخلوط بالا اضافه شد. جريان گاز کربنيک تا وقتي که شرايط بي‌هوازي گردد و رنگ معرف ريزازورين از آبي به بي‌رنگ تبديل شود، ادامه يافت. سپس مايع شکمبه صاف شده با بزاق مصنوعي به نسبت 1 (مايه شکمبه) به 2 (بزاق مصنوعي) مخلوط گرديد و در حالي که جريان گاز کربنيک به داخل مخلوط ادامه داشت، با استفاده از پيپت مخصوص مقدار 30 ميلي ليتر از مخلوط مايع شکمبه و محيط کشت در داخل سرنگ‌هاي حاوي نمونه خوراک و داراي دماي 39 درجه سانتيگراد ريخته شد، سپس با جلو راندن پيستون حباب‌هاي داخل سرنگ خارج و با گيره روي لوله پلاستيکي متصل به انتهاي سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتيگراد در دستگاه با سرعت چرخش يک دور در دقيقه قرار داده شد.

2-2-11- تزريق عصاره‌ها به سرنگ‌ها
براي تهيه‌ي سطوح مختلف عصاره‌هاي مورد آزمايش ابتدا مقدار 01/0 ميلي گرم از هر عصاره به کمک ترازوي ديجيتال توزين گرديد سپس اين مقدار در لوله فالوپ گذاشته شد و با 5/0 ميلي ليتر حلال متانول حل شد سپس حجم محلول با آب مقطر به 100 سي سي رسيده شد و با استفاده از همزن لرزه‌اي به مدت چند دقيقه هم زده شد تا از حل شدن کامل عصاره اطمينان حاصل شود به اين ترتيب سطح 100 ميلي گرم بر ليتر از عصاره مورد نظر تهيه شد. براي تهيه سطوح 200 و 300 ميلي گرم بر ليتر از عصاره نيز به ترتيب مقادير 02/0 و 03/0 ميلي گرم از هر عصاره توزين شد و مراحل فوق متعاقبا براي آن‌ها طي شد. بعد از آماده‌سازي سه سطح مورد آزمايش از هر عصاره، به منظور افزودن آن‌ها به سرنگ‌هاي از پيش آماده شده‌ي گاز تست، مقدار 6/0 ميلي ليتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ‌هاي ظريف انسولين کشيده شد و با سرعت و دقت زياد به سرنگ‌هاي گاز تست افزوده شدند.، سپس با جلو راندن پيستون حباب‌هاي داخل سرنگ خارج و با گيره روي لوله پلاستيکي متصل به انتهاي سرنگ، بسته شد. سرنگ‌ها در انکوباتور 39 درجه سانتيگراد در دستگاه با سرعت چرخش يک دور در دقيقه قرار داده شد.
2-2-12- انکوباسيون و قرائت گاز توليدي
گاز توليدي از نمونه‌ها در زمان‌هاي 2، 4، 6، 8، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از انکوباسيون قرائت و ثبت گرديد (منک و همکاران، 1988). هنگامي که حجم گاز و محتويات هر سرنگ به حدود 60 ميلي ليتر مي‌رسيد گيره پلاستيکي انتهاي سرنگ باز مي‌شد و پيستون به جلو رانده مي‌شد تا گاز خارج شده و پيستون سرنگ مجددا در موقعيت 30 ميلي ليتر قرار داده شود.

2-2-13- تعيين حجم گاز توليدي
حجم گاز توليدي بر اساس وزن نمونه در هر زمان با استفاده از نمونه‌هاي شاهد، با استفاده از روابط زير تصحيح گرديد:
رابطه (1-2) (ect – 1)b + a = P
در اين رابطه:
P =توليد گاز در زمان t
a =توليد گاز از بخش تجزيه‌پذير سريع (ميلي ليتر)
b = توليد گاز از بخش تجزيه‌پذير کند (ميلي ليتر)
c = مقدار ثابت توليد گاز بخش b (ميلي ليتر)
a+b = پتانسيل توليد گاز (ميلي ليتر)
t = زمان انکوباسيون
رابطه (2-2) “V=” (“200(” “V” _”t” “-” “V” _”b” “)” )/”W”
که در اين رابطه:
V = حجم گاز تصحيح شده بر حسب ميلي ليتر به ازاي 200 ميلي گرم ماده خشک نمونه خوراک
Vt = حجم گاز توليدي در سرنگ‌هاي حاوي نمونه خوراک بر حسب ميلي ليتر
Vb = حجم گاز توليدي در سرنگ‌هاي فاقد نمونه خوراک بر حسب ميلي ليتر
W = وزن ماده خشک نمونه خوراک بر حسب ميلي گرم (منصوري و همکاران، 1381).

2-3- تهيه و آماده‌سازي مايع شکمبه جهت تهيه محيط کشت
با توجه به اين که در مايع شکمبه مواد مغذي لازم جهت رشد کليه ميکروارگانيسم‌هاي شکمبه وجود دارد، در تهيه محيط کشت، جهت کشت باکتري‌هاي شکمبه از مايع شکمبه نيز به عنوان جزيي از ترکيب محيط کشت استفاده مي‌شود. به همين منظور براي تخمين جمعيت باکتري‌ها، ابتدا از سه راس گاو فيستول‌گذاري شده، در حالت ناشتا (قبل از وعده غذايي صبح) با استفاده از تلمبه مخصوص مايع شکمبه اخذ گرديده و به نسبت مساوي با هم مخلوط گرديد. با استفاده از 3 لايه پارچه کرباس، مايع شکمبه صاف شد. سپس براي تهيه مايع شکمبه استاندارد به روش گراب و دهوريتي (1976)، مايع صاف شده شکمبه به مدت ده دقيقه در 1000× g سانتريفوژ گرديد. قسمت مايع را جدا نموده و تا زمان استفاده در ترکيب محيط کشت، در ظروف در بسته و در فريزر (18- درجه سانتيگراد) نگهداري گرديد.

2-3-1-محيط کشت
يک محيط کشت مناسب، بايد شرايط محيطي لازم و مواد مغذي مورد نياز براي رشد ميکروارگانيسم‌ها را تامين کند (منصوري و همکاران، 1381). در محيط کشت‌هايي که در شرايط آزمايشگاهي تهيه مي‌شوند، چون جذب صورت نمي‌گيرد، براي اجتناب از اسيدي شدن بيش از حد و بالا رفتن بيش از حد فشار اسمزي محيط بايد سوبسترا و همچنين ميکروارگانيسم‌ها به اندازه کافي رقيق شده باشند (منصوري و همکاران، 1381). چون ميزان سوبستراي قابل دسترس تعيين‌کننده فرآورده‌هاي توليدي مي‌باشند، غلظت سوبسترا نبايد از 1% حجم محيط کشت بيشتر باشد و حتي مي‌تواند کمتر نيز باشد (ونسوست و همکاران، 1994). در تهيه محيط کشت قسمت عمده اکسيژن با وارد کردن گاز کربنيک از محيط خارج مي‌شود. مقادير جزيي اکسيژن باقيمانده با کربنات سديم يا سيستئين خارج مي‌شود (منصوري و همکاران، 1381). معرف ريزازورين براي ارزيابي قابليت زنده ماندن و آلودگي باکتريايي و همچنين براي تست فعاليت ضد ميکروبي به کار مي‌رود (پالومين و همکاران، 2002). معرف بي‌هوازي ريزازورين، شاخص مفيدي براي تشخيص مقادير جزيي اکسيژن است. اين معرف در حالت احيا شده و در عدم حضور اکسيژن بي‌رنگ بوده و در حضور اکسيژن به رنگ آبي مايل به صورتي در مي‌آيد (منصوري و همکاران، 1381). مايع شکمبه صاف شده و گندزدايي شده، يک منبع براي تهيه محيط کشت در مطالعاتي است که براي جدا کردن و مشخص کردن ميکروارگانيسم‌ها به کار برده مي‌شود و همچنين براي تامين مواد مغذي مورد نياز ميکروارگانيسم‌ها به محيط کشت اضافه مي‌شود (منصوري و همکاران، 1381). مقدار کافي بافر و مواد معدني مورد نياز ميکروارگانيسم‌ها با اضافه کردن محلول‌هاي نمکي تامين مي‌شود از سويي اسيدهاي چرب با زنجير منشعب،

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید