ويتامين‌ها و ساير عوامل ديگر را مي‌توان به طور مستقيم به محيط کشت اضافه کرد و يا آن‌ها را از طريق اضافه کردن مايع شکمبه صاف شده (که حدود 20% حجم محيط کشت را تشکيل مي‌دهد) تامين نمود (منصوري و همکاران، 1381).

2-3-2- تهيه محلول 0/1 درصد همين22
براي تامين آهن مورد نياز ميکروارگانيسم‌ها از محلول 1/0 درصد همين در ترکيب محيط کشت استفاده شد. با توجه به اين که همين در شرايط اسيدي و خنثي در آب حل نمي‌شود براي تهيه محلول 1/0%، ابتدا 100 ميلي گرم همين را در 10 ميلي ليتر آب مقطر ريخته و با ريختن چند قطره سود و قليايي کردن محيط، همين در آب حل گرديد و براي استفاده در ترکيب محيط کشت در يخچال (4 درجه سانتيگراد) نگهداري گرديد.

2-3-3- تهيه مخلوط اسيدهاي چرب فرار
نسبت‌هاي مشخص از اسيدهاي استيک، بوتيريک، ايزوبوتيريک، n- والريک، ايزووالريک و
آلفا-متيل-بوتيريک اسيد (شرکت مرک آلمان) با هم مخلوط گرديد و در ظرف دربسته در يخچال (4 درجه سانتيگراد) نگهداري گرديد.

2-3-4- تهيه محلول مواد معدني شماره I
براي تهيه اين محلول، مقدار 3 گرم دي پتاسيم فسفات (4HPO2K) را در آب مقطر حل نموده و به حجم يک ليتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در يخچال نگهداري گرديد.

2-3-5- محلول مواد معدني شماره II
براي تهيه اين محلول، مقادير مشخص از مونوپتاسيم فسفات (4PO2KH)، کلرور سديوم، سولفات منيزيوم، کلرور کلسيم و سولفات آمونيوم را در آب مقطر حل نموده و حجم محلول با آب مقطر به يک ليتر رسانده شد و تا هنگام مصرف در دماي يخچال (4 درجه سانتيگراد) نگهداري شد.
2-3-6- تهيه محيط کشت
محيط کشت مورد استفاده جهت شمارش باکتري‌ها به روش حداکثر تعداد احتمالي (MPN)، بر اساس روش مورد استفاده اّبيسپو23 و دهوريتي (1992) تهيه گرديد. براي تهيه محيط کشت بي‌هوازي ابتدا محلول‌هاي مواد معدني شماره I و شماره II به طور مجزا تهيه گرديد (جدول 9-2) سپس نسبت‌هاي مشخص شده از اين محلول‌ها (جدول 7-2) در بالن 2 ليتري ريخته و در حالي که جريان مستمر گاز کربنيک به داخل آن برقرار گرديد و توسط همزن الکتريکي به طور مستمر هم زده مي‌شد، محلول 1/0 درصد همين و قندهاي محلول گلوکز، سلوبيوز، مالتوز و زايلوز اضافه گرديد. از محلول 1/0 درصد ريزازورين24 به عنوان معرف براي برقراري شرايط بي‌هوازي استفاده شد. سپس عصاره مخمر، تريپتيکاز و مخلوط اسيدهاي چرب فرار، مايع شکمبه، آب مقطر و سوسپانسيون 03/0 سلولز به مخلوط اضافه گرديد و مخلوط حاصل به مدت 2 ساعت در معرض جريان گاز کربنيک قرار داده شد. سپس محلول 03/0 سيستئين هيدروکلرايد در آب مقطر و محلول 012/0 کربنات سديم نيز اضافه شد. با اضافه کردن محلول ريزازورين به محيط کشت، رنگ مخلوط بنفش مي‌شود و با ادامه تزريق گاز کربنيک به تدريج محيط کشت به رنگ ارغواني، صورتي کمرنگ درآمده و سرانجام بي‌رنگ مي‌شود.

2-3-7- توزيع محيط کشت
پس از آن که محلول بي‌رنگ شد، با استفاده از پمپ مخصوص که بر روي بالن محتوي مخلوط محيط کشت قرار داده شد، در حالي که جريان گاز کربنيک به داخل مخلوط ادامه داشت، مقداري گاز کربنيک شيشه‌هاي پني سيلين (به حجم 20 ميلي ليتر)، دميده شد تا هواي داخل آن خارج گردد و در حالي که دميدن گاز کربنيک به داخل شيشه‌ها ادامه داشت، مقدار 9 ميلي ليتر از محيط کشت اشباع شده از گاز کربنيک را به داخل لوله ريخته و سريعا درب آن بسته شد تا مانع از ورود هوا به داخل آن گردد. پس از آن که تمام محيط کشت درون شيشه‌ها ريخته شد، به منظور از بين بردن کليه ميکروارگانيسم‌هاي موجود در آن، بلافاصله شيشه‌هاي حاوي محيط کشت به مدت 15 دقيقه در اتوکلاو و با دماي 120 درجه سانتيگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدايي (استريل) گرديدند. قبل از تزريق محيط کشت به داخل شيشه‌هاي پني سيلين pH محيط کشت اندازه‌گيري شد. با توجه به اين که دميدن گاز کربنيک موجب کاهش pHمي‌شود، با اضافه کردن مقدار کمي سود يک نرمال، pH محيط کشت به 6/6 رسانده شد و در حين تزريق به داخل شيشه‌ها نيز مرتباpH محيط کشت کنترل گرديده و در صورت لزوم براي حفظ pHدر حدود 6/6، مقدار کمي سود يک نرمال، به محيظ کشت اضافه گرديد.

2-3-8- تهيه محلول رقيق کننده بي‌هوازي25
براي تهيه رقيق‌کننده بي‌هوازي (جدول 9-2) محلول‌هاي مواد معدني I و II با غلظت‌هاي مشابه در محيط کشت به کار رفته و همچنين براي نشان دادن برقراري شرايط بي‌هوازي از محلول 1/0% ريزازورين استفاده گرديد. پس از مخلوط نمودن محلول‌هاي مواد معدني I و II و اضافه کردن ريزازورين و آب مقطر، جريان گاز کربنيک (از طريق شيلنگ نازکي که تا انتهاي بالن امتداد يافته بود)، به داخل محلول برقرار گرديد و براي اشباع کردن محلول از دي اکسيد کربن، حدود 2 ساعت گاز کربنيک در داخل محلول تزريق گرديد. سپس سيستئين هيدروکلرايد و کربنات سديم اضافه شد و تا بي‌رنگ شدن محلول، جريان گاز کربنيک به داخل محلول و هم زدن آن با همزن مغناطيسي ادامه يافت. پس از بي‌رنگ شدن محلول، مشابه نحوه تزريق محيط کشت به داخل شيشه‌هاي پني سيلين به حجم 20 ميلي ليتر، مقدار 9 ميلي ليتر محلول رقيق‌کننده‌ي بي‌هوازي اشباع شده از گاز کربنيک به داخل هرشيشه ريخته شد و درب آن بسته شد و بلافاصله، به مدت 15 دقيقه در دماي 120 درجه سانتيگراد و فشار 5/1 اتمسفر گندزدايي (استريل) شدند.

2-3-9- تهيه مايع شکمبه تازه
براي هر زمان نمونه‌برداري در هر دام، ابتدا مايع شکمبه تازه از طريق فيستول از هر دام جمع‌آوري و پس از صاف کردن آن توسط پارچه مخصوص، مايع صاف شده شکمبه در بطري پلاستيکي مخصوص که در آن قبلا گاز کربنيک دميده شده بود، ريخته شد و بلافاصله با فشار دادن بطري، هواي قسمت فوقاني آن تخليه و درب آن محکم بسته شد و بطري در فلاسک محتوي آب 39 درجه سانتيگراد قرار داده شد و براي کشت دادن بلافاصله به آزمايشگاه منتقل گرديد.

2-3-10- تهيه رقت‌هاي مختلف از مايع شکمبه
تعداد 495 شيشه پني سيلين فراهم شد که از اين تعداد 270 شيشه پني سيلين براي محيط کشت و 225 شيشه براي محلول رقيق کننده بي‌هوازي در نظر گرفته شد.
قبل از تهيه مايع شکمبه تازه، شيشه‌هاي محتوي محلول رقيق کننده بي‌هوازي، در انکوباتور 39 درجه سانتيگراد قرار داده شد تا به هنگام وارد کردن مايع شکمبه به داخل محلول رقيق‌کننده تغيير ناگهاني دما، به جمعيت ميکروبي شوک وارد ننمايد. بعد از انتقال مايع صاف شده تازه شکمبه به آزمايشگاه، ابتدا مقدار 20 ميلي ليتر از مايع صاف شده شکمبه را با 180 ميلي ليتر محلول رقيق‌کننده‌ي بي‌هوازي مخلوط نموده
(ابتدا مقدار 1 ميلي ليتر از مايع صاف شده شکمبه به يک شيشه حاوي 9 ميلي ليتر محلول رقيق‌کننده بي‌هوازي تزريق شد تا رقت 1-10 حاصل شود) و با استفاده از همزن لرزه‌اي مدت سه دقيقه، مخلوط هم زده شده، سپس به منظور پرهيز از ورود احتمالي ميکروارگانيسم‌هاي موجود در محيط به داخل محلول رقيق کننده، با استفاده ازسرنگ انسولين گندزدائي شده و در دستگاه انکوباتور، مقدار يک ميلي ليتر از مايع شکمبه رقيق شده1-10 را برداشته و به داخل شيشه محتوي 9 ميلي ليتر محلول رقيق‌کننده استريل اضافه نموده و با استفاده از همزن لرزه‌اي کاملا مخلوط گرديد بدين ترتيب مخلوط 100 برابر رقيق‌شده مايع شکمبه با رقت 2-10 به دست آمد. مجددا يک ميلي ليتر از رقت 2-10 به داخل يک شيشه محتوي 9 ميلي ليتر محلول رقيق کننده ريخته شد تا رقت 3-10 حاصل شود و به همين ترتيب کار را ادامه داده و از رقت 2-10 تا 12-10 تهيه گرديد.
جدول 2-7 تا 2-11 محلول‌هاي مورد استفاده در ترکيب محيط کشت
جدول 2-7
محلول مواد معدني شماره I مقدار)گرم در ليتر(
4HPO2K 3

جدول 2-8
محلول مواد معدني شماره II مقدار)گرم در ليتر(
4HPO2K 3/0
4SO2(4NH) 6/0
NaCl 6/0
4MgSO 0/6
2CaCl 0/6

جدول 2-9
مخلوط اسيدهاي چرب فرار مقدار (ميلي ليتر)
Acetic Acid 17
Prorionic Acid 6
Butyrie Acid 4
Iso Butyrie Acid 1
N-Valeric Acid 1
Iso Valeric Acid 1
Butyric Acid – 3CH – ? 1

محلول %0/1 ريزازورين
100 ميلي گرم در صد ميلي ليتر آب مقطر

محلول %0/1 همين
100 ميلي گرم در صد ميلي ليتر آب مقطر

جدول 2-10- اجزاي محيط کشت جهت رشد باکتري‌هاي شکمبه
درصد در محيط کشت
اجزاي محيط کشت
15
Mineral Solution I (V/V)
15
Mineral Solution II (V/V)
0/1
(V/V) %1/0 Resazurin
40
Rumen Fluide (V/V)
23/7
Distilled Water (V/V)
0/1
0/1
Glucose (W/V)

0/1
Cellobiose(W/V)
0/1
Maltose (w/V)
0/1
Xylose (W/V)
0/75
(V/V) %3 Cellolose Suspension
0/1
(W/V) % 1/0 Hemin Solution
0/2
Trypticase (W/V)
0/05
Yeast Extract (W/V)
0/45
VFA Mixture (V/V)
1/67
(V/V) %3 Cystein-HCL-Water
3/33
(V/V) %12 Sodium Carbonate Solution
0/0100
CO2 Gas Phase

جدول 2-11- ترکيب رقيق کننده بي‌هوازي (A.D.S)
محلول مواد معدني شماره I 15%
محلول مواد معدني شماره II 15%
محلول ريزازورين 0/1%
سيستئين هيدروکلرايد 0/05%
کربنات سديم 0/3%
آب مقطر 69/65%

2-3-11- تلقيح و نگهداري کشت‌هاي انجام شده
در هر يک از زمان‌هاي مورد نظر، بلافاصله پس از تهيه رقت‌هاي مختلف از 1-10 تا 12-10 از مايع شکمبه، رقت‌هاي10-10،11-10 و 12-10 را انتخاب نموده و براي هر سطح از هر عصاره، سه تکرار براي هر رقت در نظر گرفته شد. بدين معني که براي هر سطح (100، 200 و 300)، سه تکرار براي رقت10-10، سه تکرار براي رقت 11-10 و سه تکرار براي رقت 12-10 در نظر گرفته شد. بدين ترتيب به هر سطح از هر عصاره 9 شيشه‌ي حاوي محيط کشت تعلق گرفت و از آنجا که هر عصاره در سه سطح (100، 200 و 300 ميلي گرم بر ليتر) مورد آزمايش قرار مي‌گرفت به اين ترتيب براي هر عصاره 27 شيشه محيط کشت در نظر گرفته شد و از آنجا که اثر هر سطح از عصاره‌ها بر جمعيت ميکروبي شکمبه در دو ساعت صفر و چهار ساعت پس از مصرف خوراک مورد بررسي قرار گرفت در مجموع براي هر عصاره 54 شيشه حاوي محيط کشت تهيه شد و از آنجا که در کل اثر پنج عصاره مورد آزمايش قرار گرفته بود در کل براي تمام عصاره‌ها 270 شيشه محيط کشت تهيه شد. سپس به هر شيشه محتوي محيط کشت مقدار 6/0 ميلي ليتر از سه سطح هر عصاره با استفاده از سرنگ انسولين تزريق شد. لوله‌هاي حاوي محيط کشت مدت 14 روز در انکوباتور 39 درجه سانتيگراد نگهداري شده و هر روز دو بار محتويات لوله‌ها به آرامي هم زده مي‌شد. در عين حال تعداد 90 شيشه بدون افزودن عصاره (تنها شامل محيط کشت و تنها حاوي مايع شکمبه)، براي هر يک از رقت‌هاي10-10، 11-10 و 12-10 سه تکرار در زمان 0 و سه تکرار در زمان 4 ساعت پس از مصرف خوراک و تعداد 3 شيشه بدون افزودن عصاره و ميکروب وتعداد 10 شيشه حاوي تنها عصاره‌ها (سطوح 200 و 300 از هر عصاره) نيز به عنوان نمونه‌هاي شاهد تهيه گرديدند.

2-4- تخمين تعداد باکتري‌ها
پس از 14 روز انکوباسيون شيشه‌هاي محتوي محيط کشت، از دو معيار تغيير رنگ (کدر شدن) با مشاهده چشمي و کاهش pH محيط کشت براي تعيين وضعيت رشد باکتري‌ها در هر لوله استفاده شد. پس از تعيين اين دو معيار براي هر رقت از مايع شکمبه، با استفاده از جدول MPNتعداد باکتري‌ها در هر ميلي ليتر مايع شکمبه برآورد گرديد. براي اين منظور، در سه رقت 10-10 و 11-10و 12-10 و با بازديد چشمي و اندازه‌گيري pH رشد يا عدم رشد باکتري‌ها در محيط کشت مشخص و در صورت رشد باکتري‌ها، مثبت تلقي شد. با توجه به اين که براي هر رقت 3 تکرار وجود دارد تعداد محيط کشت‌هاي مثبت در سه رقت متوالي يادداشت گرديد و با مراجعه به جدول MPN عدد جدول قرائت مي‌گردد.

2-5- شمارش تک‌ياخته‌ها
پس از

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید