بررسي پلي مورفيسم C/T936 A/C.َ2578َ هاي سقط هاي مکرر خودبخودي حائز اهميت مي باشد(Abbas, Nieters,2008, Becker, Cordes,2007).
پلي مورفيسم ژن VDR يک پلي مورفيسم ديگري است که در اين پايان نامه مورمطالعه قرار گرفته، قابل ذکر است که اين پلي مورفيسم در مورد بيماري سقط مکرر بررسي نشده و اين بررسي براي اولين بار در اين پايان نامه صورت گرفته است. در مطالعات گذشته ارتباط بين پلي مورفيسم هاي ژن VDR. و انواع مختلفي از سرطانها ، ديابت نوع 1، فشار خون بارداري ، ديابت بارداري مورد بررسي قرار گرفته است. در اين قسمت به مطالعه سرطانهاي پستان ، پروستات ، و تخمدان مي پردازيم .ارتباط بين ويتامين D و خطر سرطان پستان، نتايج متناقضي به‌دست آمده است. گرچه چند مطالعه به عمل آمده حاکي از آن است که بين مصرف ويتامين D و خطر سرطان پستان رابطه معکوسي وجود دارد، در مطالعات ديگر هيچ ارتباط يا حتي ارتباط مثبتي مشاهده نشده است (يعني اينکه افرادي که مقدار بيشتري ويتامين D مصرف مي‌کردند با بالاتر بودن خطر اين سرطان مواجه بودند). در ارتباط ويتامين D و خطر ابتلا به سرطان پستان که بايد به وضعيت گيرنده تومور و سوخت و ساز استروژن و انواع ديگر ژنهاتوجه کرد.
ويتامين D از طريق متصل شدن به گيرنده ويتامين ((VDR يا) vitamin D receptor) بر سلول‌ها تأثير مي‌گذارد. گيرنده ويتامين D يکي از تنظيم‌کننده‌هاي نسخه‌برداري ژن است که در هسته سلول يافت مي‌شود. گيرنده ويتامين D که به ويتامين D متصل است T به گيرنده رتينوييد متصل مي‌شود، و کمپلکسي (مجموعه‌اي) که حاصل مي‌شوددر روند ادامه کار تاثير گذار است(Becker, Cordes,2007).
در سال 2008 فردي به نام عباس و همکارا ن پلي مورفيسم FOKI را در جمعيتهاي زنان مبتلا به سرطان پستان آلماني مورد بررسي قرار دادند. اين بررسي در ميان 1408 زن بيمار و 2612 زن سالم داراي ارتباط معني داري نبود . در اين بررسي تفاوت معني داري بين فراواني اللي وژ نوتيپي بيمار و کنترل وجود نداشت. و هيچ تعاملي نيز بين سطح سرمي و vDR مشاهده نشد(Abbas, Nieters,2008).
برترون و همکارانش در سال 2001 به بررسي اين سرطان ميان پلي مورفيسمهاي FOKIوBSMI در بين 181زن بيمار و 241 زن سالم در جمعتهاي قفقازي انگليس پرداختند که در اين مطالعه نيز ارتباط معني داري بين گروه کنترل و بيمار وجود نداشت (Bretherton-Watt, Given-Wilson,2001).گاي و همکارانش نيز اين بررسي را در جمعيت قفقازي انگليس در بين 313 گروه کنترل و 410 گروه بيمار انجام دادند در اين بررسي پليمورفيسم BSMIداري ارتباط معني داري با سرطان پستان بود اما در FOKI ارتباط معني داري مشاهده نشد(Guy, Lowe,2004).
مکلوج در سال 2007 نيز 500 زن بيمار و 500 زن سالم را در جمعيت قفقازي انگليس مورد بررسي قرار داد که نتايجي مشابه نتايج گاي و بترون را به دست آورد.(McCullough, Rodriguez,2005)
چن در سال 2005 در جمعيت زنان آمريکا مطالعه بزرگي در را بطه با سرطان پستان وپلي مورفيسم هاي FOKI ,BSMIانجام داد . اين مطالعه بين 1676 زن بيمار و 1234 زن سالم صورت گرفت که دراين بررسي ارتباط معني داري بين گروه کنترل وبيمار مشاهده شد. و تفاوت معني داري بين توزيع اللي و ژنوتيپي FFمشاهده گرديد(Chen, Bertone-Johnson,2005).
در ادامه مطالعه خود به بررسي اين پلي مورفيسم در ارتباط با سرطان پروستات ميپردازيم. اين بيماري داري بروز بالاي مرگ و مير مي باشد. ازجمله عوامل خطر در اين بيماري را مي توان بهداشت، سن ، وضعيت هورموني ،و سابقه خانوادگي نيزنام برد. در شرايط باليني سرطان پروستات، تر کيبات فعال ويتامين Dممکن است شرايط بيماري را به تاخير بيندازد. در طي مطالعاتي که در رابطه با اين بيماري در سال 2004 توسط چتري در جمعيت آمريکايي ميان 552 فرد سالم 520 زن بيمار صورت گرفت ارتباط معني داري بين اين پلي مورفيسم و بيماري پروستات مشاهده نشد .(Cheteri, Stanford,2004)
لي و همکارانش در يک مطالعه بزرگ ميان 1066 فرد سالم و1618 فرد بيمار در جمعيت امريکايي پلي مورفيسم FOKIرا مورد بررسي قرار دادند که در اين مطالعه نيز ارتباط معني داري بين اين بيماري و پلي مورفيسم FOKI وجود نداشت .(Li, Stampfer,2007) هليک و همکارانش نيز در سال 1999 اين بررسي را در ميان 630 زن سالم 565 فرد بيمار انجام دادند که دوباره ارتباط معني داري بين اين پلي مورفيسم و بيماري پروستات مشاهده نکردند(Holick, Stanford,2007).
گزارش ديگري توسط لسکومبي در جمعيتهاي انگلستان صورت گرفته که ارتبا طي ميان اين پلي مورفيسم و بيماري مشاهد نشده است.(Luscombe, French,2001)
سرطان تخمدان يک سرطان کشنده است. زيرا تظاهر باليني اين بيماري در اواخر دوره آن صورت مي گيرد. و روش غربالگري براي تشخيص زود هنگام اين بيماري وجود ندارد. عوامل خطر مختلفي را مي توان براي اين بيماري نام برد از جمله :تعدد بارداري. سابقه ي خانوادگي، استفاده از استروئيد هاي پيشگيري از بارداري ، بهم خوردن تعادل بين استروژن و پروژسترون در دوران يائسگي از عوامل سرطان تخمدان است .در مطالعات آزمايشگاهي نشان داده شد که ويتامين Dدر سرطان تخمدان نقش داشته باشد . و رسپتور ويتامين D براي عملکرد تخمدان از طريق بيوسنتز استروژن و تنظيم بيان ژن آرو ماتاز لازم مي باشد. (K?stner, Denzer,2009)
در مطالعات صورت گرفته توسط لوري و همکارانش ارتباط ميان سرطان تخمدان و پلي مورفيسم FOKIدر ميان 313 زن سالم و 574 زن بيمار در جمعيت قفقازي انگليس در سال 2007 مورد ارزيابي واقع شد. که اين بررسي افزايش خطر ابتلا به سرطان تخمدان را براي افرادي که حامل ژنوتيپ هتروزيگوت بودند 2.5 برابر افرادي که داراي ژنوتيپ هموزيگوت بودند اعلام کرد. (K?stner, Denzer,2009)
کلندن و همکارانش در جمعيتهاي قفقازي انگليس ميان 170 فرد بيمار و 323 فرد سالم اين پلي مورفيسم را مورد ارزيابي قرار دادند. که بر خلاف نتايج قبلي ارتباط معني داري بين گروه کنترل و بيمار وجود نداشت. (K?stner, Denzer,2009)
در ادامه مطالعاتي که در گذشته صورت گرفته است بر روي ارتباط بين اين پلي مورفيسم و اختلالات فشار خون بالا در در دوران بارداري توسط آنتي در سال2011 در برزيل صورت گرفت. که نشان داد اين پلي مورفيسم با فشار خون بارداري همراه است. سيستم اندوکريني ويتامين D تاثير مهمي بر مدولاسيون سيستم ايمني و عملکرد اندوتليالي خواهد داشت که اين آثار نقش به سزايي در فشار خون حاملگي دارد. اخيرا VDR در سلولهاي بسيار زيادي بيان مي شود که به عنوان مثال سلولهاي جفت را مي توان نام برد. واقع شدن اين پلي مورفيسم در جفت ممکن است در طول بارداري نقش داشته باشد(Bodnar, Catov,2007)
در مطالعه هاي که در ايران توسط اسلاني و همکارانش در سال 2011 بين 303 زن که دچار ديابت بارداري بعد از 12 هفته از زايمان صورت گرفت که ارتباط معني داري بين پلي مورفيسم FOKIو ديابت بارداري وجود دارد.(Aslani, Hossein-Nezhad,2011)
در سال2009 نمونه خون 21 زن که جنين زودرس در هفته 24-35 داشتند و 98 نمونه خون بدون عارضه جنيني در جمعيتهاي مورد مطالعه اسرائيلي بررسي شد ارتباط معني داري ميان تولد زودرس و FOKI مشاهده نمودند. نقص درژن VDR، باعث نارسايي در دوران بارداري ،پره کلامپسي،مقاومت به انسولين، ديابت حاملگي و مختل شدن توسعه اسکلتي مي شود.(Bubanovic,2004)
بر طبق مطالعات اخير ، VDRدر جفت و اندومتر بيان ميشود و همچنين ويتامين هاي D3 بيان سيتوکين هاي التهابي توسط سلول هاي دسي جواي انساني را مهار مي کند. اين ويتامن توليد استروژن و پروژسترون را توسط سلول هاي جفت القا مي کندبا توجه به مطالب فوق اختلال در کاهش سطح سرمي، پلي مورفيسم ژن VDR اختلال در بيانVDR مي تواند به عوارض مختلف حاملگي دچار شود.با توجه به مطالب گذشته و تاثير پلي مورفيسم VDRما بر اين شديم تا اين پلي مورفيسم را در رابطه با سقط مکرر در جمعيتهاي ايراني مورد بررسي قرار دهيم.

فصل سوم

مواد و روشها
3-
روش بررسي
3-1- جمعيت مورد مطالعه
اين مطالعه از نوع مورد – شاهدي بوده که 150 نفر از بين زنان مبتلا به سندرم سقط مکرر خودبخودي (داشتن سابقه حداقل سه يا بيش از سه سقط) که در سال 1391 به مرکز فوق تخصصي درمان ناباروري و سقط مکرر ابن سينا مراجعه کرده بودند، انتخاب شدند. معيار خروج از مطالعه وجود ناهنجاري هاي آناتوميک، اختلالات هورموني، اختلالات کبدي و بيماري التهاب لگني بوده است. 100 خانم بدون سابقه سقط و داراي حداقل دو باروري موفق (به منظور حذف موارد سقط مکرر ثانويه)به عنوان گروه شاهد از ميان زناني که خواهان تولد نوزاد با جنسيت مشخص بودند انتخاب شدند. به منظور نمونه گيري خون و انجام طرح، از کميته اخلاق در پژوهش هاي پزشکي پژوهشگاه ابن سينا مجوز لازم اخذ شد و تمام افراد مورد مطالعه رضايت نامه تدوين شده را آگاهانه امضا نمودند.

3-2- استخراج DNA به روش( Salting out)
روشهاي متعددي براي استخراج DNA وجود دارد که در اين پايان نامه روش (استخراج DNA به وسيله رسوب نمک) انجام شد.
مواد، محلول ها و وسايل لازم براي استخراجDNA
جدول 3-1 : مواد لازم براي استخراج DNA
Na2EDTA(Plusone, Sweden), (C10H14N2Na2O2×H20),
Tris-HCl ( USB, USA)[(CH2OH)3 CNH2. HCl)]
NaCl ( Merck,Germany )
HCl ( Mojallali Chemical Laboratoris, Iran )
NaOH ( Merck, Germany )
SDS ( Plusone, Sweden ) (C12H25OSO3Na))
آب مقطر دوبار تقطير استريل
ايزوپروپانول (C2H6OH) ( Merck, Germany )
پروتئيناز K ( ( Sigma, USA
اتانول ( Merck, Germany )
دستگاه سانتريفوژ يخچال دار (Hettich, Germany )
ميکروتيوب ( ml5/1) Treefflab, Germany ))
سمپلر متغير?l) 10- 5/0 ul) , (100-10( Eppendorf, Germany ) (
دستگاه اسپکتروفتومتر) (Picodrop,UK

3-2-1- تهي? محلولهاي مورد نياز
* بافر TES (Tris-EDTA-Salt, pH: 7.5-8)
براي تهيه اين بافرابتدا محلولهاي زير تهيه شد که در زير توضيح هر کدام از آنها آمده است:
– Tris-HCl(PH:.8): 14/121 گرم از Tris-HCl را در داخل آب مقطر استريل حل کرده و سپس تنظيم pH با HCl صورت گرفت.
– :.EDTA(0.5M, pH: 8)1/186گرم دي سديم اتيلن دي آمين تترا استات را که در ساختمانش حاوي 2 ملکول آب است در mL800 آب مقطر ريخته و روي همزن مغناطيسي قرار داده سپس pH محلول را با استفاده از NaOHبه 8 رسانده، پس از حل شدن، حجم محلول با آب مقطر به يک ليتر رسيد. در نهايت محلول بدست آمده به کمک فيلتر ميلي پور ?m 0.2 در زير هود فيلتر شده و در حجم هاي کوچک تقسيم و در يخچال نگهداري شد
– NaCL 0.5 M)) :2/292 گرم NaCl در ml 800 آب مقطر حل شده و سپس حجم نهايي محلول به يک ليتر رسيد.
براي تهيه بافر TES به صورت زير عمل مي کنيم:
– ml 10 از Tris-HCl (1M) ،ml30 از( 5M) NaClو ml20 ازEDTA (0.5M) با هم مخلوط شده و حجم نهايي محلول با آب مقطر به ml100 رسانده شد و سپس محلول مورد نظر به کمک فيلتر ميلي پور استريل شد. لازم به ذکر است pH محلول با (1M ) HCl روي 8-.47. تنظيم گرديد .
– TE (1X , pH=8) ::ml10 از 1M)) Tris-HCl را با ml2 از( EDTA(0.5Mمخلوط کرده و حجم نهايي محلول با آب مقطر استريل به 1 ليتر رسانده شد و سپس به کمک فيلتر ميلي پور استريل شد.
مراحل استخراج DNA
از هر فرد ml 5 خون محيطي گرفته و در لوله حاوي ul 200 از EDTA ( 0.5M) ريخته شد. خون تا فراهم شدن مقدمات سرد نگه داشته شد. مراحل ذيل بر روي نمونه هاي خوني انجام گرديد:
1. سانتريفوژ با دور g 1000 به مدت

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید