10 دقيقه.
1. پلاسما(مايع رويي) را دور ريخته لايه گلبول هاي سفيد و گلبول هاي قرمز باقي ميماند .
2. به مقدار ml 10-8 آب مقطر سرد به مخلوط باقيمانده اضافه شد. (به منظور ليز RBCها)
3. سانتريفوژ مجدد با دور g 1000 به مدت 20 دقيقه.
4. مايع رويي را دور ريخته و روي رسوب به مقدار ml 6-5 آب مقطر سرد اضافه گرديد و خوب تكان داده شد.
5. سانتريفوژ با دور g 1000 به مدت 15 دقيقه.
6. مراحل 5و 6 تکرار شده تا رسوب صورتي کم رنگ ظاهر شد.
7. به رسوب فوق مقدار ul3000 از بافر TES اضافه گرديد، خوب تكان داده شد تا كاملا حل شود، سپس به آن ul 250 از) 10% SDS (و ul 25 از پروتئينازK اضافه گرديد و به آرامي تكان داده شد(اين محلول باعث پاره شدن غشاي هسته و آزاد شدن رشته هاي DNA مي شود).
8. انكوباسيون در بن ماري° C 37 در طول شب(. Overnight) ويا c°55 در 2 ساعت
9. مقدار ml 2000 کلريدسديم 5 مولار به لوله آزمايش فوق اضافه گرديد و به آرامي تكان داده شد. سپس با دور 1000 به مدت 20 دقيقه سانتريفوژ شد، محلول رويي به لولة جديدي منتقل شد( در اين مرحله رسوب باقي مانده حاوي پروتئين هاي تخريب شده ميباشد)
10. مقدار ml 4 از ايزوپروپانول به هر لوله اضافه گرديد و محلول به آرامي تكان داده شد تا كلاف DNA ظاهر گردد( الکل باعث به تعليق درآوردن رشتههاي DNA شده به طوري که ميتوان اين کلافهاي سفيد رنگ DNA را با چشم غير مسلح مشاهده نمود).
11. كلاف DNA به يك ميكروتيوب استريل منتقل گرديد و سپس به مدت 10 دقيقه با دورg 800 سانتريفوژ شد.
12. مايع رويي را دور ريخته و روي رسوب حدودul 500-200 اتانول 70 % به منظور شسته شدن نمکهاي اضافي ريخته شد و به مدت1 دقيقه با دور g 800 سانتريفوژ شد.
مايع رويي را دور ريخته و ميكروتيوب را تا تبخير مايع باقيمانده در محيط آزمايشگاه نگه داشته، سپس به آن X)1 TE(يا آب مقطر دو بار تقطير استريل اضافه شد)حجم بافر TE يا آب مقطر بستگي به مقدار DNA دارد و از ul 200 تا ul 10 متغيير ميباشد. DNA هاي استخراج شده در دماي °c20- نگهداري شدند) .

3-3- بررسي کمي و کيفي استخراج DNA
پس از استخراج DNA کيفيت وکميت آن توسط روشهاي زير مورد ارزيابي قرار ميگيرد.
3-3-1- بررسي کمي DNA استخراج شده با اسپکتروفوتومتر
دستگاه اسپکتروفوتومترغلظت و OD نمونه مورد نظر را با استفاده از سرسمپلرهاي طراحي شده با قابليت عبور نور UV مورد بررسي قرار ميدهد در واقع آناليز جذب UV توسط نوکلئوتيدها تخمين صحيحي از غلظت اسيد نوکلئيک هاي موجود در يک نمونه را به ما مي دهد. از سوي ديگر نرم افزار اين اسپکتروفتومتر داراي خاصيت محاسبه اتوماتيک مقادير مورد نياز براي تعيين غلظت، درجه خلوص وغيره مي باشد براي تعيين خلوص نمونه بايستي جذب را يک بار در 260 نانومتر( طول موجي که در آن DNA داراي حداکثر جذب مي باشد) و بار ديگر در 280 نانومتر( طول موجي که پروتئين حداکثر جذب را دارد) اندازه گرفت و با استفاده از نسبت جذبي nm 280/260 مقدار ناخالصي را تعيين کرد. يک نمونه خالص DNA (عاري از آلودگي پروتئيني و حلال هاي آلي) حداکثر جذب را در 260 نانومتر نشان مي دهد و نسبت جذب درآن حدود 8/1خواهد بود. در صورت افزايش اين نسبت ، آلودگي RNA و درصورت کاهش آن آلودگي پروتئيني مشخص مي شود. اطلاعات خروجي براي هر نمونه به صورت منحني قابل مشاهده مي باشد که داراي امکان ذخيره و بازيابي مجدد در فايل هاي مجزا و با فرمتExcel براي بررسيهاي بعدي مي باشد.

3-3-2- مواد و وسايل لازم
1. دستگاه اسپکتروفتومتر ( Picodrop,UK )
2.سرسمپلر (Pickodrop,UK )
3.سمپلر ( Gilson,France )

3-3-3- مراحل انجام کار
1. کاليبر دستگاه اسپکتروفوتومتر با X)1 TE(با حجمي به ميزان ul 3 به عنوان بلانک.
2. برداشتن نمونه حجمي از هر نمونه به ميزان ul 3 با سر سمپلر و قرارگرفتن سر سمپلر در محفظه مخصوص خود.
3.تعيين نوع نمونه مورد بررسي براي دستگاه جهت اندازهگيري نوري آن که در اينجا نمونه ما(double strand DNA (ds-DNA است.
4..محاسبه نسبت جذب280/260 به منظور تعيين ميزان آلودگي )نسبت حاصله در صورتيکه بين 6/1 تا9/1 باشد مطلوب است، در غير اينصورت ميتوان يکبار ديگرمرحل? شستشو با اتانول % 70 را انجام داد(.

3-3-4- محاسبه غلظت DNA
لازم به ذکر است که اسپکتروفوتومتر نتيجه را بصورت نمودار نمايش ميدهد که در زير تصوير آن قابل مشاهده است.

شکل 3-1 : محاسبه غلظت و ميزان جذب در نمونه ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر

3-3-5- بررسي کيفيDNA.
مواد مورد نياز: پودر آگارز، بافر (1X)TAE ، دستگاه الكتروفورز افقي همراه با لوازم جانبي براي ريختن ژل، اتيديوم برمايد 10 mg/ و دستگاه ژل داکيومنت.پس از استخراج DNA، با توجه به تعداد نمونههاي استخراج شده، کاستهاي ژل آگارز 1% آماده شد تا DNAهاي استخراج شده مورد آناليز کيفي قرار بگيرند. نحوه کار به اين صورت بود که براي کاست 7 تايي 3/0گرم آگارز در ml 30 بافر TAE 1x و براي کاست 21 تايي 8/1 گرم آگاروز در ml 180 بافر TAE 1x با استفاده از حرارت يا در ماکروفر قرار داده و حل کرده و پس از افزودن مقدار مناسب اتيديوم برمايد مقدارµl 2 براي حجم ml 180 بافر TAE 1x در کاست ريخته شد. و پس از سفت شدن، ژل براي الکتروفورز مورد استفاده قرار گرفت. براي اطمينان يافتن از کيفيتDNAهاي استخراج شده و عدم وجود شکستگي در آنهامقدار 2 ميکرو ليتر از هر نمونه DNAرا روي ژل اگارز 1%طبق توضيح داده شده الکتروفورز گرديد،و با مشاهده الگوي الکتروفورز، کيفيت DNAاستخراج شده مشخص گرديد.

شکل 3-2 :الکتروفورز براي تعيين آناليز کيفي
3-4- ژنوتايپ کردن نمونهها (ژنوتايپينگ)
3-4-1- انتخاب پرايمرهاي مناسب براي هر موتاسيون
3-4-1-1- طراحي آغازگر
قواعد مشخصي براي اينكه بتوان با اطمينان يك جفت پرايمر موثر را انتخاب كرد، وجود ندارد. در حال حاضر پرايمر بيش از هر عامل ديگري عامل موفقيت يا شكست در يك واكنش تكثيري است. بعضي قواعد راهنمايي هاي مفيدي را در مورد طراحي آغازگر مي كنند كه ذيلا به آنها اشاره شده است.
1. با طول پرايمر، كوچك اتصال غيراختصاصي افزايش يافته و با طول پرايمر بزرگتر، سرعت هيبريداسيون کاهش مييابد.
2. مقدارG-C دو پرايمرForward و Reverese با هم مشابه بوده و حداکثر 50-60 درصد باشد.
3. آغازگرها را بايد از نظر مكمل بودن با هم كنترل شوند35 تا از تشکيل پرايمر دايمر جلوگيري مي شود.
4. پرايمر دايمر يك تكثير مصنوعي است كه اغلب درمحصولPCRمشاهده مي شود و عبارت است از يك قطعهي دو رشته اي كه طول آن تقريبا به مجموع دو پرايمر نزديك است و هنگامي مشاهده مي شود كه يك پرايمر توسط آنزيم پليمراز به روي پرايمر ديگر گسترش يابد مكانيزم واقعي كه چگونه پرايمر دايمر تشكيل مي شود بدرستي مشخص نيست. پرايمرها با انتهاي مكمل ?3مستعد تشكيل دايمر هستند. ضعف در آنزيم Taq باعث پليمريزاسيون مستقيم الگوي غير هدف مي شود. در هر حال چنانچه پرايمر دايمر بعنوان مانعي مشاهده شود، مي توان آن را تاحدودي با غلظت حداقل پرايمر و آنزيم كاهش داد.
5. در انتهاي3 پرايمر بايد حداقلC يا G قرار گيرد. در توالي هايي پرايمرهايي كه انتهاي3 آنها غني ازG+C مي باشد احتمال اتصال اشتباهي افزايش مي يابد.
6. بايد تا حد امكان از تواليهاي پاليندروميك داخل پرايمرها جلوگيري كرد.
7. نسبت چهار نوكلئوتيد در آغازگر حتي المقدور يكسان باشد.
8. آغازگر به توالي تكرار شونده ختم نشود.
9. دمايTm دوپرايمر آغازگرنزديك هم باشد.
10. حد مجاز دماي اتصال پرايمر طراحي شده بايد بين56-55 باشد. دماي تكثيرايده آل72 مي باشد.
11. درجه حرارتي كه پرايمر به DNA الگو متصل مي شود، به طول آغازگر و مقدارGC آن بستگي دارد
12. . فاصله بين پرايمرهايي كه با DNAي هدف هيبريد مي شود، بطور معمول كمتر از 15 كيلو باز مي باشد. در حقيقت يك كاهش اساسي در سنتز موثر هنگامي كه محصول تكثير متجاوز از 1000 باز مي شود، مشاهده مي گردد. به همين دليل طول قطعه مورد تكثير درPCR نبايد بيش از3 کيلو باز باشد و حد مطلوب كمتر از1 کيلو باز مي باشد. تكثير قطعات بسيار طويل و بالاي 40 کيلو باز مقدور است، اما نياز به روشهاي ويژه اي دارد.

2-5-1-2- مواقعي كه پرايمرها كاملاُمكمل DNA هدف( الگو) نباشند
پرايمرهايي كه براي ايجاد موتاسيون در يك ژن طراحي ميگردند.پرايمرهايي كه سمت `5 آنها جايگاه شناسايي آنزيم محدودگر تعبيه ميشود تا بتوان محصول PCR را توسط آن آنزيم برش داد. اين كار براي كلون كردن محصول PCR انجام ميشود.
پرايمرهايي كه لازم است محصول PCR آنها داراي پروموتور باشد و براي بيان يك ژن كاربرد دارند، فاصله دو پرايمر بايد كمتر از 10 کيلوباز باشد ( كارآيي همانند سازي براي محصول PCR بيش از 3 کيلو باز كمتر است ). بهتر است پرايمرها را بر حسب كاري كه لازم داريم طراحي شوند.

2-5-1-3- دماي ذوب آغازگر
دماي اتصال بايد بقدر كافي پايين باشد تا پرايمر وDNA الگو قادر به اتصال باشند و از سوي ديگر بايد به قدر مناسب بالا باشد تا از تشكيل اتصالات غيراختصاصي جلوگيري كند. دماي اتصال از روي شاخصي به نام درجه حرارت ذوب محاسبه مي شود. دماي ذوب 36 درجه حرارتي است كه در آن نيمي از DNAبه صورت تك رشته اي درآمده است. يكي از مهمترين مشخصات Tm وابستگي آن به تركيب بازي DNA است G .وC سه پيوند هيدروژني و بازهاي آدنين و تيمين دو پيوند هيدروژني دارند. بنابراين هر چقدر مقدار گوانين و سيتوزين در DNAبيشتر باشد، Tmبيشتر است.
Tm = 4× (G + C) +2× (A + T)
.

2-5-1-4- غلظت پرايمرها و روش اندازه گيري آن
غلظت پرايمر بين5/0 تا 5/1 ميكرومول و حد مطلوب 1/0 براي يك واكنش25 ميكروليتري مي‌باشد. غلظت بالاي پرايمر باعث بسط غيراختصاصي و پرايمر دايمر مي شود.براي ساختن محلول کار پرايمر، دانستن وزن مولکولي پرايمر لازم است، که با استفاده از فرمول زير به دست ميآيد:

M.W = ( A.312 ) + (C.288 ) + (G.328 ) + ( T.303) – 61
A ،C ،G و T تعداد نوکلئوتيدها در قطعهي پرايمر هستند. البته وزن مولکولي پرايمرها و همچنين OD آن توسط شرکتهاي سازنده ارائه مي شود.
اتصال پرايم:
دما و مدت زمان لازم براي اتصال پرايمر به :
1) طول پرايمر ، 2) تركيب نوكلئوتيد و 3) غلظت پرايمر بستگي دارد. با توجه به طيف فعاليت آنزيم Taq پلي مراز كه در محدوده70 درجه سانتيگراد مي باشد .دماي اتصال در محدوده 72-55 درجه سانتيگراد بطور معمول بهترين نتيجه را مي دهد. افزايش دماي اتصال بسط غيراختصاصي را در انتهاي 3 پرايمر كاهش مي دهد. دماي پايين،تكثير همراه با غلظت اختصاصي بودن واكنش را كاهش مي دهد.
بسط پرايمر:
مدت زمان بسط بستگي به عوامل مختلف دارد.
1) طول توالي هدف ، 2) غلظت توالي هدف و 3) دماي تكثير دارد. بسط پرايمر بطور معمول دردماي 65درجه سانتيگراد انجام مي شود يك زمان بسط يک دقيقه اي در 72 درجه سانتيگراد براي فرآورده هاي معادل كافيست. براي هر موتاسيون، پرايمر مناسب جهت ژنوتايپ کردن هر نمونه DNA از طريق واکنشهاي زنجيرهاي پليمراز 37و چند شکلي در طول قطعات محدود38 از منابع معتبر انتخاب مي شود و اين پرايمرهاي انتخاب شده بوسيله نرمافزارهاي بيوانفورماتيکي و Gene Runner مورد ارزيابي قرار ميگيرد. در اين بررسي با Blast کردن پرايمرها، پرايمرها از لحاظ شناسايي صحيح موقعيت و همچنين عدم Miss Match بررسي مي شود.? ?آنچه در برنامه? BLAST?انجام مي شود پيدا کردن جفت

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید